大肠杆菌表达(大肠杆菌表达系统的优缺点)

外源基因在大肠杆菌中的表达问题

生物体对密码子的偏爱性：不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白编码基因，对于同一氨基酸所对应的简并密码子，使用频率并不相同，也就是说生物体基因对简并密码子的选择具有一定的偏爱性。

决定这种偏爱性的因素有三：A. 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高，而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势。

B. 密码子与反密码子相互作用的自由能适中的作用强度最有利于蛋白质生物合成的迅速进行；
弱配对作用可能使氨酰基tRNA分子进入核糖体A位需要总费更多的时间；
而强配对作用则可能使转肽后核糖体在P位逐出空载tRNA分子耗费更多的时间。

如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；
如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；
C. 细胞内tRNA的含量。

②密码子偏爱性对外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有不同程度的差异性，因此，外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。

一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： A. 外源基因全合成 B. 同步表达相关tRNA编码基因 2．载体的选择 所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子（如PL、tac、T7等）和SD序列。

(1)核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。

大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。

mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）(2)大肠杆菌核糖体结合位点的特征 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；
。

构建分泌型大肠杆菌工程菌表达外源基因的关键前提条件是_

构建分泌型大肠杆菌工程菌表达外源基因的关键前提条件包括： 合适的载体：选择适合表达外源基因的载体，如pET等，同时该载体需具备足够的复制数和选择性，以确保外源基因的高效表达和筛选。

适宜的启动子：选择适合目标基因表达的启动子，例如T7启动子等，以确保外源基因能够高效转录和翻译。

信使RNA的完整性：目标基因的信使RNA需要保持完整性，以确保其能够被翻译为正确的蛋白质。

适宜的培养条件：培养条件的优化可以提高大肠杆菌的生长速度和表达外源基因的效率，如温度、培养基组成、pH值等都需要优化。

合适的纯化方法：对于表达的外源蛋白质，需要选择合适的纯化方法，以保证其纯度和活性，如亲和层析、离子交换层析等方法。

构建分泌型大肠杆菌工程菌表达外源基因的关键前提条件是_高老师，Ti质 粒的遗传结构中 ，与植物感染与致瘤的元件主要是什么呢构建分泌型大肠杆菌工程菌表达外源基因的关键前提条件包括： 合适的载体：选择适合表达外源基因的载体，如pET等，同时该载体需具备足够的复制数和选择性，以确保外源基因的高效表达和筛选。

适宜的启动子：选择适合目标基因表达的启动子，例如T7启动子等，以确保外源基因能够高效转录和翻译。

信使RNA的完整性：目标基因的信使RNA需要保持完整性，以确保其能够被翻译为正确的蛋白质。

适宜的培养条件：培养条件的优化可以提高大肠杆菌的生长速度和表达外源基因的效率，如温度、培养基组成、pH值等都需要优化。

合适的纯化方法：对于表达的外源蛋白质，需要选择合适的纯化方法，以保证其纯度和活性，如亲和层析、离子交换层析等方法。

在Ti质粒的遗传结构中，与植物感染和致瘤相关的主要元件包括以下几个： T-DNA（转移DNA）：T-DNA是从质粒中被转移至植物细胞中的DNA片段，其中包含着一些与植物感染和致瘤相关的基因，如激素合成基因、生长因子基因、细胞分裂基因等。

这些基因的表达会导致植物细胞的异常生长和分化，从而形成肿瘤组织。

vir（细菌致病性）基因：vir基因是指质粒中的一组基因，它们编码着调控T-DNA转移和植物感染的蛋白质。

这些蛋白质能够识别植物细胞表面的信号，从而促进T-DNA的转移和感染。

oriV（起始复制位点）：oriV是指质粒中的起始复制位点，它能够启动质粒的复制和转移。

在感染植物细胞时，oriV能够帮助质粒在细胞内复制和稳定维持。

tra（转移）基因：tra基因是指质粒中编码着T-DNA转移所需的蛋白质。

这些蛋白质能够形成细菌外膜的复合物，将T-DNA和其他必需的质粒组件导入植物细胞内部。

综上所述，T-DNA、vir基因、oriV和tra基因是Ti质粒遗传结构中与植物感染和致瘤密切相关的元件。

Ti质 粒的遗传结构中 ，与植物感染与致瘤的元件主要是什么呢在Ti质粒的遗传结构中，与植物感染和致瘤相关的主要元件包括以下几个： T-DNA（转移DNA）：T-DNA是从质粒中被转移至植物细胞中的DNA片段，其中包含着一些与植物感染和致瘤相关的基因，如激素合成基因、生长因子基因、细胞分裂基因等。

这些基因的表达会导致植物细胞的异常生长和分化，从而形成肿瘤组织。

vir（细菌致病性）基因：vir基因是指质粒中的一组基因，它们编码着调控T-DNA转移和植物感染的蛋白质。

这些蛋白质能够识别植物细胞表面的信号，从而促进T-DNA的转移和感染。

oriV（起始复制位点）：oriV是指质粒中的起始复制位点，它能够启动质粒的复制和转移。

在感染植物细胞时，oriV能够帮助质粒在细胞内复制和稳定维持。

tra（转移）基因：tra基因是指质粒中编码着T-DNA转移所需的蛋白质。

这些蛋白质能够形成细菌外膜的复合物，将T-DNA和其他必需的质粒组件导入植物细胞内部。

综上所述，T-DNA、vir基因、oriV和tra基因是Ti质粒遗传结构中与植物感染和致瘤密切相关的元件。

大肠杆菌作为外源基因表达系统有哪些优缺点

影响外源基因在大肠杆菌中高效且活性表达的主要因素有哪些

影响外源基因在大肠杆菌中高效且活性表达的主要因素有哪些一、外源基因的表达效率①启动子的强弱。

有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一，也可以说，转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤。

因此，选 择强的可调控启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。

最理想的可调控启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起 细胞死亡等问题。

当细胞数目达到一定的密度，通过多种诱导(如温度、药物等)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始转录。

②核糖体结合位点的有效性。

SD 序列是指原核细胞 mRNA 5`端非翻译区同 16S rRNA 3`端的互补序列。

按统计学的原则，一般 SD 序列至少含 AGGAGG 序列中的 4 个碱基。

SD 序列的存在对原核细胞 mRNA 翻译起始至关重要。

③SD 序列和起始密码子 AUG 的间距。

AUG 是最首选的起始密码子，GUG、UUG、AUU 和AUA有时也用作起始密码子，但非最佳选择。

另外，SD 序列与起始密码子之间的距离以 9±3 为适宜。

④密码子组成。

尽量避免使用罕用密码子如：AGG、AGA(Arg)、CUA(Leu)等。

二、表达质粒的拷贝数和稳定性：多数情况下，目标基因的扩增程度同基因表达成正比，所以基因扩增为提高外源基因的表达水平提供了一个方便的方法。

对于原核和酵母表达体系而言，选择 高拷贝数的质粒，以其为基础，组建表达载体。

表达载体的稳定性是维持基因表达的必需条件，而表达载体的稳定性不但同表达载体自身特性有关，也与受体细胞的 特性密切相关。

所以在实际运用时，要充分考虑两方面的因素而确定好的表达系统。

利用选择压力、尽量减少表达载体的大小、通过建立可整合到染色体中去的载体 等待方式，可以增加表达质粒的稳定性。

三、表达产物的稳定性：①组建融合基因，产生融合蛋白。

融合蛋白的载体部分通过构象的改变，使外源蛋白不被选择性降解。

这种通过产生融合蛋白表达外源基因，特别是相对分子 质量较小的多肽或蛋白编码的基因，尤为合适。

②产生可分泌的蛋白。

如将外源基因表达产物分泌到大肠杆菌细胞的周质或直接分泌到培养基。

③外源蛋白可以在宿主细胞中以包涵体形式表达，这种不溶性的沉淀复合物可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，也便于纯化。

④选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，有可能减弱表达产物的降解。

⑤采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性。

四、工程菌的培养条件：由于细菌在100L以上的发酵罐中的生长代谢活动与实验室条件下200mL摇瓶中的生长代谢活动存在很大差异，在进行工业化生产时，工程菌株大规模 培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。

优化发酵过程既包括工艺方面的因素也包括生物学方面的因素。

工艺方面的因素如选择合适的发酵系统或生 物反应器，目前应用较多的有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器和气升式反应器等。

生物学方面的因素包括多方面，首先是与细菌生长密切相关的条件或因素，如发酵系 统中的溶氧、pH 值、温度和培养基的成分等，这些条件的改变都会影响细菌的生长及基因表达产物的稳定性。

生物因素的第二方面是对外源基因表达条件的优化。

在发酵罐内工程菌 生长到一定的阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。

使外源基因在特异的时空进行表达不仅有利于细胞的生长代 谢，而且能提高表达产物的产率。

生物因素的第三方面是提高外源基因表达产物的总量。

外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。

在保持单个 细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。

五、细胞的代谢负荷：外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢，而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达。

合理地调节好宿主细胞的代 谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达水平不可缺少的一个环节。